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Diagnóstico de Laboratorio

del Moquillo Canino. 

PALABRAS CLAVE Moquillo canino > virus moquillo canino > diagnóstico clínico > diagnóstico de laboratorio

MVZ. Luis Antonio Calzada Nova.

MVZ. Leticia Vázquez Manríquez.

Laboratorio Dac Novis

Resumen

El diagnóstico del moquillo canino requiere de un conocimiento detallado de las características del virus, de los factores de riesgo ambientales, de convivencia con otros perros y del tipo de dueño que favorecen la posibilidad de la infección. Asimismo, se requiere una correcta valoración médica de los pacientes para determinar su estado de salud, en general y en caso de observar datos de enfermedad confirmar con un correcto interrogatorio y una sistemática exploración física, la posibilidad establecer los diagnósticos de presuntivo y de sospecha.

 

Para establecer el diagnóstico de certeza el médico veterinario zootecnista dispone de una variedad de recursos de laboratorio que le permitirían confirmar sus hipótesis diagnósticas con un alto grado de certeza, pero con la premisa de que cada prueba debe de ser interpretada teniendo como base el conocimiento detallado de la fisiopatología de la enfermedad y los signos clínicos observables dentro de cada etapa. Es factible, obtener pruebas que nos den resultados falsos negativos por un incorrecto muestreo del paciente y no por la imprecisión de la prueba misma. Hasta ahora no hay mejor sistema de diagnóstico para reconocer una enfermedad con síntomas tan diversos y a veces desconcertantes, que la valoración clínica de un médico veterinario zootecnista bien entrenado.

Diagnóstico de certeza

Establecido el diagnóstico presuntivo, es decir determinada la hipótesis diagnóstica, y siguiendo el razonamiento hipotético-deductivo, lo procedente es la realización de pruebas de laboratorio o gabinete confiables, que permitan confirmar con certeza su aprobación o rechazo.

 

Las pruebas de laboratorio con las que se pretende confirmar el diagnóstico de moquillo canino han ido evolucionando conforme los avances científicos lo han permitido, y todas ellas tienen ventajas y desventajas que el médico veterinario zootecnista debe ponderar para darle su valor diagnostico real.

 

Todas las pruebas de laboratorio basan su confiabilidad en su sensibilidad y su especificidad, que en palabras sencillas se entiende:

  • Sensibilidad, es la capacidad que tiene una prueba para detectar los casos positivos, expresado en porcentaje. Cuanto mayor es la sensibilidad del test, más enfermos serán diagnosticados adecuadamente.

 

  • Especificidad, es la capacidad que tiene una prueba para detectar exclusivamente los casos positivos, expresado en porcentaje, en otras palabras, es la capacidad de la prueba para dar como casos negativos a los casos realmente sanos. Cuanto mayor es la especificidad del test, más sanos serán diagnosticados adecuadamente.

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Uno de los elementos que mas afecta la sensibilidad de las pruebas para el diagnóstico del moquillo canino es el lugar del muestreo y el momento, dentro de la fisiopatología en el que se realice, con lo cual se pueden afirmar los siguientes enunciados:

  • Las tonsilas, es el mejor lugar en donde muestrear a un paciente con moquillo canino agudo, ya que, se sabe que el virus es identificable desde el día 1 de la infección y permanece en todos los tejidos linfoides, mientras no se reestablezca la respuesta inmune sistémica y se produzca el aclaramiento viral en todos los tejidos linfoides y tisulares.

 

  • En los primeros 6 días, el virus se multiplica en el tejido linfoide pero no en las células epiteliales, por lo que el muestreo en el periodo de incubación debe de realizarse en las tonsilas, o de ser factible en otro tejido linfoide.

 

  • El virus aparece en la sangre, asociada a linfocitos y monocitos circulantes infectados, después del día 3 y la viremia asociada a leucocitos es persistente en los pacientes que padecen la enfermedad con más intensidad. A diferencia de los perros que tienen una respuesta inmune moderada a normal en donde la viremia será de menor duración.

 

  • El virus se localiza en la mucosa conjuntival, nasofaríngea, vaginal y/o prepucial después del día 7 posinfección. Siendo la mucosa conjuntival el sitio en donde persiste durante más tiempo la infección cuando se decida muestrear en las mucosas. 

 

  • En pacientes con neuroinfección aguda, por lo general ocurre después de 21 días de haberse infectado, puede cursar con viremia persistente asociada a leucocitos si el paciente no establece una buena respuesta inmune, o bien, evolucionar con neuroinfección, ya sin viremia y con aclaramiento viral de los tejidos epiteliales y linfoides, en estos pacientes el virus se puede identificar con técnicas de inmunohistoquímica en biopsias de las almohadillas digitales, también puede ser de gran utilidad el análisis del líquido cerebro espinal, para identificar la infección en el sistema nervioso central.

 

  • En los perros con neuroinfección crónica el realizar pruebas de diagnóstico de moquillo para detectar antígenos en tejidos linfoides o epiteliales tendrá, generalmente, resultado será negativo. La prueba más sensible para estos casos será la de RT-PCR de líquido cerebroespinal.

Con las premisas anteriores establecidas se analizarán las diferentes pruebas de laboratorio que permitirían confirmar el diagnóstico de la enfermedad.

Diagnóstico de Laboratorio

 

El diagnóstico de laboratorio es necesario para confirmar la infección por el virus del moquillo canino y así validar o desechar nuestra hipótesis diagnóstica.

 

Aislamiento viral

El aislamiento del virus es la prueba definitiva de la infección por el virus del moquillo canino, que tendría un 100% de sensibilidad y especificidad en los casos agudos, no así en los crónicos, actualmente puede obtenerse con un cocultivo de linfocitos de animales sospechosos y líneas celulares que expresen la molécula CD 15 (SLAM), después del aislamiento inicial, el virus puede adaptarse para crecer en líneas celulares primarias de pulmón de perro o convencionales, incluyendo la de riñón de perro  Madin-Darby o células Vero, lo cual ha eliminado la necesidad de usar células mononucleares activadas. 

 

El aislamiento viral complementado con microscopía electrónica sería la prueba definitiva de que se ha identificado al agente causal de la enfermedad, pero su uso se limita a la investigación, en virtud de que su implementación es de alto costo, de equipamiento y entrenamiento muy especializado, por lo que resulta totalmente impráctico para su aplicación en la clínica.

Figura 3. Termociclador utilizado para las técnicas de PCR

Detección directa e identificación de ácidos nucleicos virales

 

Con el avance de la biotecnología moderna se han desarrollado los ensayos diagnósticos basados en la secuenciación y la amplificación de ácidos nucleicos. Estos métodos están entre las mejores técnicas para detectar agentes patógenos a partir de muestras clínicas, con alta sensibilidad y especificidad. 

 

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus variantes son las herramientas más comúnmente utilizadas para el diagnóstico de enfermedades de los animales en todo el mundo. El procedimiento de PCR consta de dos partes: 1) extracción de ácidos nucleicos y 2) reacción de amplificación. Lo ideal es que ambos procesos estén automatizados para disminuir errores y aumentar la rapidez diagnóstica de todo el proceso. Las tres variantes básicas incluyen: PCR en tiempo real, PCR múltiple y PCR en transcripción reversa (RT-PCR). 

Para el diagnóstico del moquillo canino mediante la técnica de PCR es relevante recordar que el virus contiene un genoma RNA linear simple de sentido negativo de cadena sencilla, lo que condiciona el uso de la técnica RT-PCR.

 

En la RT-PCR el genoma viral la cadena viral RNA se retrotranscribe mediante una enzima llamada transcriptasa inversa lo que permite obtener una cadena de DNA complementario (DNAc), el cual se amplifica mediante una PCR tradicional. La amplificación exponencial mediante RT-PCRT supone una técnica altamente sensible, que puede detectar un número de copias de RNA muy bajo.

 

La sensibilidad, especificidad de la RT-PCR hacen de esta técnica la primera elección como prueba diagnóstica de moquillo canino.

 

Para incrementar la sensibilidad de la prueba RT-PCR propone obtener las muestras de tonsilas, mucosa conjuntival, costra flogística y orina. 

 

Ventajas: Muy alta sensibilidad (100%) y especificidad (100%), alta precisión y exactitud, puede detectar virus que no pueden cultivarse, puede trabajar muestras que contiene virus inactivado como resultado de almacenaje, transporte o fijación del tejido inadecuada o prolongada, puede detectar infecciones virales latentes, puede detectar virus unido a anticuerpos en las últimas etapas de una infección aguda o en algunas infecciones persistentes, requiere poca cantidad de muestra.

 

Desventajas:Requiere equipamiento y entrenamiento especializado, equipamiento de alto costo, reactivos caros, hay pocos laboratorios que ofrezcan la prueba. (Imagen 3)

La interpretación de la PCR-RT se debe hacer con prudencia dentro del contexto clínico sobre todo cuando el resultado es negativo.

 

Detección e identificación de antígenos virales

 

Las técnicas inmunodiagnósticas disponibles para el diagnóstico de la enfermedad producida por el virus del moquillo canino son altamente confiables y disponibles para la práctica clínica y siempre están sujetas a interpretación, ante el resultado obtenido por éstas técnicas se requiere correlacionar la evolución fisiopatológica y los síntomas clínicos con las evidencias del restablecimiento de la respuesta inmune del paciente, ya que, este último dato puede modificar el  resultado de la prueba, por ejemplo: 

  • En los pacientes que se infectan del virus y tienen una buena capacidad de respuesta inmune producirán anticuerpos antes de los 9 días, por lo que, se recuperarán sin haber tenido signos clínicos, y las pruebas inmunodiagnósticas para detección de antígenos virales resultarán negativas.

  • En los pacientes con respuesta inmune mas tardía u moderada, se observarán signos clínicos después del periodo de incubación y si realizamos pruebas inmunodiagnósticas para detección de antígenos virales, en los primeros días de la enfermedad clínica las pruebas resultarían positivas, sin embargo, si las pruebas son realizadas semanas más tarde cuando el organismo ya pudo establecer una respuesta inmunitaria, es muy probable que la prueba sea negativa. Lo crítico es que, si el paciente tiene mas de tres semanas evolucionando con su enfermedad, es muy factible que ya tenga neuroinfección y respuesta inmunológica sistémica activa, con aclaramiento de la presencia viral en los tejidos linfoides y epiteliales, con mejoría de los signos clínicos respiratorios y gastrointestinales, y tener una prueba inmunodiagnóstica negativa, por supuesto sería una prueba falsa negativa, ya que, en los siguientes días se podría observar convulsiones tónico-clónicas, dolor cervical y paraespinal, mioclonos rítmicos, estupor mental, anosmia, etc.

  • En los pacientes con nula o escasa respuesta inmune las pruebas inmunodiagnósticas para detección de antígenos virales siempre resultarán positivas y el pronóstico de esos pacientes será negativo.

Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA)

 

Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes “específicos”. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Existen diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30 000 daltons) el marcador enzimático que se emplea en estos análisis se une con un ligando, al producto de esta unión marcador-ligando se le llama conjugado, que puede ser un antígeno, un anticuerpo específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para el anticuerpo primario.

 

Los conjugados enzimáticos son antígenos o anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de elección. 

 

Las combinaciones de enzima y ligando que se emplean en los diversos métodos ELISA incluyen: 

1) peroxidasa de rábano y su sustrato, peróxido de hidrógeno que en presencia de cromógeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible; 2) galactosidasa beta y su sustratoo-nitrofenil-beta-Dgalactopiranósido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible, o 3) fosfata alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que también se transforma en nitrofenolato. Se utiliza ácido sulfúrico para inhibir la actividad enzimática y estabilizar el producto final de reacción que tiene color. Por sus características catalíticas las enzimas son marcadores muy sensibles y versátiles. 

 

Una sola proteína enzimática puede transformar en algunos minutos gran número de moléculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad.

Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales se adsorbe un ligando sobre un soporte sólido, actualmente microplacas de 96 pocillos. (Imagen 4)

Figura 4.  Microplaca para la prueba de ELISA.

Figura 5. Kit comercial para inmunocromatografía para diagnóstico de moquillo canino.

Para incrementar la sensibilidad de la prueba de ELISA para el diagnóstico de moquillo canino se debe de obtener muestras de tonsilas, mucosa conjuntival y costra flogística.

Ventajas: Equipamiento relativamente barato, procedimientos técnicos rápidos y sencillos, alta precisión y exactitud, reactivos relativamente baratos y de larga vida, gran variedad de substratos y cromógenos que incrementa su versatilidad, muy buena sensibilidad y alta especificidad, puede detectar sustancias en el orden de nanogramos y picogramos por mililitro, requiere poca cantidad de muestra (µl), de menor costo, menor tiempo, más estables.

 

Desventajas: Requiere equipamiento y entrenamiento especializado, tiene menos sensibilidad que las técnicas de PCR.

 

Es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más modernas cuyas principales ventajas son la simplicidad y rapidez de la prueba. Cada vez son más las aplicaciones de esta técnica, tanto en el ámbito de los test, debido a que no es necesario reactivos ni instrumentación adicional, como en el campo clínico. (Imagen 5)

Se puede realizar mediante un dispositivo simple desarrollado para detectar la presencia de un antígeno o un anticuerpo específico en la muestra. Este tipo de pruebas son utilizadas comúnmente para el diagnóstico médico tanto para pruebas en el consultorio o de empleo en el laboratorio. Se presenta en un formato de tira, en el cual la muestra problema fluye a lo largo de un sustrato sólido por medio de una acción capilar. (Imagen 6)

 

La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través de una membrana de nitrocelulosa. 

Figura 6. Kit comercial para inmunocromatografía para diagnóstico de moquillo canino.

La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. 

Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.

 

La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso como rosa o azul (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas.

La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. 

 

Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.

 

Ventajas: Gran disponibilidad, barata y de larga vida, procedimientos técnicos rápidos y sencillos, alta especificidad (95- 99%), moderada sensibilidad (75 – 89%)

 

Desventajas: Amplia existencia de proveedores y distribuidores con validación cuestionable de las pruebas, tiene menos sensibilidad que las técnicas de PCR, inmunofluorescencia y ELISA; requiere interpretación por el clínico.

Figura 7. Prueba de inmunohistoquímica positiva 

para moquillo canino en epitelio bronquiolar respiratorio. 

Inmunofluorescencia

 

Es un inmunoensayo como la ELISA, la inmunocromatografía o la inmunihistoquímica; que basan sus técnicas en la capacidad que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a un determinado antígeno; pero se diferencia de otras técnicas en que aquí el marcador unida al anticuerpo es una molécula fluorescente por ejemplo, el isocianato de fluoresceína. El anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico y luego se expone la muestra así tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio de un monocromador. Esta luz de onda corta genera fluorescencia de la molécula marcadora en el conjugado, que a su vez emite luz a una longitud de onda más larga (verde, amarillo o naranja). Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometría o puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia.

 

Es una técnica sensible y específica para muestreo en frotis sanguíneo, frotis conjuntival, tonsilas, sedimento urinario, médula ósea, líquido cerebroespinal.

 

Ventajas: Se pueden obtener resultados rápidos, se pueden localizar microorganismos específicos en un grupo mixto, alta especificidad (98%), alta sensibilidad (98%)

 

Desventajas: Costosos en reactivos y equipo, requiere personal especializado, tiene menos sensibilidad y especificidad que las técnicas de PCR.

Inmunohistoquímica

 

Es una técnica se basa en la tinción de tejido fijado e incluido en parafina, procedente de biopsias de piel, ganglios linfáticos, médula ósea y otros tejidos, con anticuerpos monoclonales específicos. La reacción antígeno-anticuerpo en esta técnica es incolora y para hacerla evidente, se utilizan algunos métodos como la fluorescencia o las reacciones enzima-sustrato que convierten al cromógeno del conjugado, sin color, en un compuesto coloreado que permite identificar el lugar en donde se depositaron los anticuerpos utilizados.

Figura 8. Prueba de inmunohistoquímica positiva 

para moquillo canino en epitelio bronquiolar respiratorio. 

Figura 9. Cuerpos de inclusión en células epiteliales de un frotis de mucosa conjuntival. 

El complejo antígeno-anticuerpo se identifica en el tejido mediante microscopia, localizándolo allí donde se ha unido a moléculas específicas presentes en las células del tejido en estudio. (Imagen 8).

 

Los datos de alta especificidad que proporciona el análisis inmunohistoquímico son de gran importancia para el diagnóstico final.

La inmunohistoquímica y los métodos de tinción de anticuerpos fluorescentes son de utilidad para demostrar la presencia del antígeno viral en frotis de conjuntiva y en biopsias cutáneas (antemortem) o en secciones de pulmón, intestino, estómago, riñón, cerebro y vejiga urinaria colectados durante la necropsia.

 

En un estudio con la técnica de inmunohistoquímica in vivo, se obtuvieron biopsias de la piel del cuello en perros infectados por el virus del moquillo canino y realizaron el diagnóstico con un 80% de sensibilidad y un 100% de especificidad.

Figura 10. Cuerpos de inclusión en células epiteliales de un frotis de mucosa conjuntival. 

Citopatología

 

Esta técnica permite identificar estructuras subcelulares anormales formadas como resultado de la infección viral por el moquillo canino. Frecuentemente corresponden a los lugares donde se realiza el ensamblaje de la partícula viral. 

 

Su naturaleza y localización en la célula es característica de cada infección viral, para el caso de los paramixovirus es común observarlos como cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos en leucocitos, eritrocitos y células de estirpe epitelial, con la salvedad de que en las células del sistema nervioso central puede observarse cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos e intranucleares. (Imágenes 9 y 10)

 

En la enfermedad producida por el virus del moquillo canino solo son visibles en etapas específicas de la infección, de modo que su ausencia no significa que no haya infección viral, pero el hecho de encontrarlos es suficiente evidencia para confirmarla.

 

Ventajas: Se pueden obtener resultados rápidos, no se necesita equipamiento sofisticado ni caro, no se requiere entrenamiento especializado, se puede realizar en el consultorio, su sensibilidad puede estar próxima al 90%, la cual se puede incrementar si se revisan muestras provenientes de conjuntiva, costra flogística y sedimento urinario. Al igual que las pruebas de inmunocromatografía se puede usar como una prueba de tamizaje para el diagnóstico en la clínica y su confirmación, especialmente ante las pruebas negativas, con la realización de pruebas más sensibles y específicas como ELISA o inmunofluoresencia o por PCR-RT.

Desventajas: Es inespecífica, ya que sólo evidencia una infección viral, sin poder precisar el tipo de virus.

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